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Protein G琼脂糖纯化树脂是用于纯化和分离IgG。Protein G是一种分离自G链球菌的细胞壁蛋白质，主要通过Fc片段与哺乳动物的IgG结合。天然Protein G含有3个IgG结合位点以及白蛋白和细胞表面结合的位点。重组的Protein G中去除了白蛋白和细胞表面结合域，减少了非特异性结合。另外，为了增强其固定能力，设计了3个Cys标签到重组的protein G的C末端。尽管protein A和protein G的三级结构非常相似，但是它们的氨基酸组成差异很大，因此具有不同的结合特征。protein G能够用于纯化分离哺乳动物单克隆和多克隆IgG，它们不与protein A结合。与protein A相比，protein G对大多数哺乳动物的IgG具有更强的亲和力，特别是对于某些亚类，如人的IgG3，小鼠的IgG1和大鼠的IgG2a。另外protein G不与人的IgM，IgD和IgA结合。

• 有更广泛的与IgG种类结合能力及更强的亲和力；
  
• 不同于Protein A的特异性结合；
  
• 琼脂糖介质；
  
• 没有特异性的白蛋白结合；
  
• 优化的均质的重组配体；
  
• 载量更高。

• 缓冲液准备
  结合/洗涤缓冲液(Binding/Wash Buffer)：0.15M NaCl，20mM Na2HPO4，pH7.0～7.5
  洗脱缓冲液(Elution Buffer)：0.1M柠檬酸，pH3.0或0.1M甘氨酸，pH3.0
  中和液(Neutralizing Buffer)：1M Tris-HCL，pH8.5
  也可选购百奥莱博产品：结合/洗涤缓冲液(货号：GS4764)、洗脱缓冲液(货号：GS4763)和中和液(货号：GS2013)
  注意：所用水和Buffer在使用之前建议用0.22μm或0.45μm滤膜过滤。
  
• 纯化步骤
  该纯化过程针对0.5mL柱体积进行了优化，试剂的体积可以根据柱的大小进行放大或缩小。
  
  • 样品制备：上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用结合/洗涤缓冲液1:1对血清样品、腹水或细胞培养液稀释或将样品加入到结合/洗涤缓冲液中透析过夜；
    
  • 层析柱和树脂制备：轻轻倒转瓶子混合浆料以完全悬浮树脂。预先加入1mL结合/洗涤缓冲液到层析柱中，使用移液管将1mL的Protein G纯化树脂转移到柱中，静置待树脂沉淀后将缓冲液从柱孔排出，然后再加入5倍柱体积的结合/洗涤缓冲液进行平衡；
    
  • 样品纯化：待树脂中平衡液流净后，缓慢将待纯化样品加入到树脂中，收集流出液；
    
  • 用10～15倍柱体积的结合/洗涤缓冲液洗脱非特异性吸附的杂蛋白，收集流出液；
    
  • 再用5～10倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱抗体，收集流出液，即目的蛋白组分；
    
  • 洗脱后的目的蛋白组分需要立即调成中性，以免低pH值是纯化后的蛋白变性失活，一般建议使用洗脱组分体积的1/10的中和液进行中和；
    
  • 在位清洗：依次使用3倍柱体积的结合/洗涤缓冲液，5倍柱体积的去离子水，5倍柱体积的20%乙醇洗涤树脂。树脂加入相同体积的20%乙醇，保存在2～8℃，不可冻存；
    
  • 柱的再生：Protein G纯化树脂可以重复使用而无需再生，但随着一些变性物质的沉淀和蛋白的聚集，往往造成流速和结合载量都下降并严重影响柱子的性能，这时需要对树脂进行清洗。
    去除一些沉淀或变性物质
    用2倍柱体积的6M盐酸胍溶液进行清洗，然后立即用5倍柱体积的1×PBS,pH7.4清洗。
    去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质
    用3～4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积的1% Triton X-100清洗，然后然后立即用5倍柱体积的1×PBS,pH7.4清洗。

• 在进行IP实验前需确认蛋白表达情况并用抗体做探针识别诱饵蛋白和目的蛋白，如果诱饵蛋白通过WB没有检测到，那无需进行免疫沉淀实验，必须确认诱饵蛋白是否已经表达；
  
• 每份裂解液建议含有的大致相同数目的蛋白，此步可通过多次转染及尽可能修正使用的DNA数目、蛋白表达时间或细胞株来解决；
  
• 建议选择易于培养且有高转染效率的细胞。

• 取100μL的Protein G纯化树脂(50μL树脂体积+50μL的填料保护液)，加入2倍体积的1×PBS洗涤Protein G纯化树脂两次，再向Protein G纯化树脂中加入1倍体积的1×PBS缓冲溶液混合。建议在洗涤Protein G纯化树脂时切开移液器吸头，以免珠粒被刺破；
  
• 每100μL的Protein G纯化树脂(50μL树脂体积+50μL的1×PBS)中加入1mL细胞裂解液，4℃下在摇床或轨道振荡器上孵育10min，在后续的测试中裂解液能够减少蛋白质与树脂的非特异性结合；
  
• 4℃下以12000g离心10min去除Protein G纯化树脂，将上清液转移到干净的离心管中；
  
  • 步骤1～3为裂解液预清理，因部分内源物的低活性及蛋白印迹对目的蛋白检测的特异性，在一般情况下，预清理是可以省略的，但在第一次进行特异的免疫沉淀时，不建议省略此步。
• 确定细胞裂解物中蛋白质浓度(若用Bradford法测定浓度，测试前至少1∶10稀释细胞溶解物，因为裂解缓冲液中的洗涤剂对考马斯亮蓝会有干扰作用，请先确认好裂解液中相关组分对蛋白定量方法的影响)；
  
• 用1×PBS稀释细胞裂解物至约1μg/μL细胞蛋白的含量，以减少缓冲液中洗涤剂的浓度。而对于倾向于低浓度表达的免疫沉淀蛋白，可使用浓缩的细胞液(10μg/μL)。
  
• 每500μL细胞裂解液中加入相应稀释倍数后的捕获抗体(1μg/μL或10μg/μL)。定量免疫沉淀目标蛋白的最佳量必须对每个样本进行实证检验；
  
• 在摇床或轨道振荡器上，将细胞裂解物与抗体混合后的产物4℃下轻轻摇动2h或过夜；
  建议：在激酶和磷酸酶测定中免疫活化酶的孵育时间为2h。
  
• 再取100μL的已用1×PBS洗涤过的Protein G纯化树脂(50μL树脂体积+50μL的1×PBS)加入到细胞裂解物/抗体混合物中，4℃下在摇床或轨道振荡器上轻轻晃动1h或过夜来捕获免疫复合物(以保证填料始终处于混悬状态)；
  
• 4℃下以12000g离心收集树脂，此时树脂上已带有捕获抗体和相关的蛋白复合体，用移液枪小心吸取上清液并预留10～20μL上清液作为树脂保护液，多余上清液弃掉，用800μL预冷RIPA裂解液或1×PBS缓冲液洗涤球珠3次，清洗请通过轻弹或颠倒试管温和重选树脂填料，整个过程保持低温环境；
  
• 向树脂中加入60μL的2×Loading Buffer，轻轻混匀，能够允许足够的容量来运行三个泳道；
  
• 将树脂煮沸5min，使得免疫复合物与球珠分离，室温下14000g离心除去珠粒，转移上清液20μL进行SDS-PAGE分析；
  
  • 若样品冻融后再使用时必须再次进行煮沸后再进行SDS-PAGE电泳。